Родилась в богатой немецко-еврейской семье, детство провела в Европе (Вена, Париж), росла в Калифорнии. В Кембридже слушала лекции по психологии Уильяма Джемса, потом училась медицине в Университете Джонса Хопкинса (Балтимор), курса не закончила. В 1902 году приехала с братом в Париж, где и провела всю оставшуюся жизнь.
Надо сказать, что Гертруда Стайн оставила свой след в модернистской литературе прежде всего не как автор, а как организатор своего рода «литературного кружка» для молодых англоязычных писателей, для многих из которых она была наставником и зачастую спонсором. Её квартира на улице Флёрюс (6 округ) стала одним из центров художественной и литературной жизни Парижа до Первой мировой войны и позднее.
Гертруде принадлежит авторство термина «потерянное поколение» (использованного Э. Хемингуэем в качестве эпиграфа к своему роману «И восходит солнце»), которым она называла эмигрировавших за границу американских писателей, часто собиравшихся у неё в салоне на улице Флёрюс, 27. Термин впоследствии послужил определением для целой группы писателей послевоенного времени, выразивших в своих произведениях разочарование в современной цивилизации, пессимизм и утрату прежних идеалов (сам Э. Хемингуэй, а также Дж. Дос Пассос, Томас Элиот, Ф. С. Фицджеральд и др.). Стайн коллекционировала и пропагандировала новейшее искусство (прежде всего, кубизм), собирала работы Пикассо (известен его портрет Стайн, 1906), Брака, Шагала, Модильяни, Гриса, Паскина, поддерживала художников Парижской школы. Она была в дружеских отношениях и многие годы переписывалась с Матиссом, Пикассо, Максом Жакобом,Хемингуэем, Фицджеральдом, Уайлдером. Хемингуэй в своём романе «Праздник, который всегда с тобой» пишет, что Гертруда не любила Джойса и Паунда до того, что было нежелательно произносить их имена у неё в доме.
Гертруда Стайн утверждала, что среди американских писателей по ёмкости слова Шервуд Андерсон не знал себе равных и что «никто в Америке, кроме Шервуда, не мог сочинить ясного и энергичного предложения». По её мнению, из молодых писателей предложение получается естественным только у Фицджеральда, первый роман которого «По эту сторону рая» произвёл на неё большое впечатление (как и «Великий Гэтсби» впоследствии).
В 1907 Стайн познакомилась с Алисой Токлас, которая стала её пожизненной спутницей. С ней они скрывались в деревенском доме в годы Второй мировой войны.
Писательница, как и её мать, умерла от рака. Похоронена на кладбище Пер-Лашез.
Экспериментальная, близкая к кубизму поэзия и проза Стайн (сб. «Нежные бутоны», 1914; роман «Становление американцев», 1925, и др.), ориентированные на европейский авангард, но при этом стремившиеся передать американский дух, колорит, склад мысли и устную речь, никогда не находили широкого читательского признания. Единственным исключением стала «Автобиография Алисы Б. Токлас» (1933), живой и остроумный очерк Парижа в годы перед Первой мировой войной, написанный от лица подруги, — эта книга многократно переиздавалась, переведена на многие языки.
Гертруда Стайн изображена на известном полотне Павла Челищева «Феномены», на полотне Пабло Пикассо «портрет Гертруды Стайн». Она фигурирует в игровом фильме Алана Рудольфа «Модернисты» (1987 год), в романе Уолтера Саттертуэйта «Маскарад» (1998 год, в рус. пер. — «Клоунада»), в произведении Э. Хемингуэя «Праздник, который всегда с тобой», а также в фильме Вуди Алена «Полночь в Париже» (2011 год). На тексты Стайн писали музыку американские композиторы Вирджил Томпсон (1934 год, 1947 год) и Джеймс Тинни (1970 год), немецкий композитор Ирис тер Шипхорст (Inside-outside II, 1989 год), музыкальную драму «To Be Sung» по «лирической опере» Стайн написал французский композитор Паскаль Дюсапен (1993 год). Памятник писательнице поставлен в Брайант-парке в Нью-Йорке.
